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MB6046/MB6044均為線粒體熒光探針，MB6044為綠色熒光（490nm，516nm），MB6046為紅色熒光（579nm，599nm），兩者均可染活細胞（不能染組織）。與MB6046不同的是，MB6044定位線粒體的能力不受線粒體膜電位的影響，但MB6044不適合于醛類固定，會使熒光信號丟失，因此更適合活細胞染色。而MB6046染色后可根究實驗需求進行固定（醛類）和透化（Triton-100），探針依然維持在細胞內(nèi)，且更適合雙標實驗。

1、Fura-2 AM的熒光比較弱，最大激發(fā)波長為369 nm，最大發(fā)射波長為478 nm，并且其熒光不會隨鈣離子濃度改變而改變；Fura-2 AM進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fura-2，從而被滯留在細胞內(nèi)。Fura-2和鈣離子結(jié)合后，最大激發(fā)波長為335 nm (最大激發(fā)波長隨離子濃度的不同而有所不同)，最大發(fā)射波長為505 nm。

2、Fluo-3 AM進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細胞內(nèi)。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。Fluo-3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為506 nm，最大發(fā)射波長為526 nm。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488 nm左右，發(fā)射波長為525-530 nm。

3、Fluo-4 AM是最常用的檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。Fluo-4 AM將Fluo-3 AM結(jié)構中的氯原子替換成了氟原子，導致它的最大激發(fā)波長會向短波長處偏離10 nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長488 nm，所以用氬激光器激發(fā)時，F(xiàn)luo-4的熒光強度會比Fluo-3強一倍，F(xiàn)luo-4可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為494 nm，最大發(fā)射波長為516 nm。Fluo-4 AM(鈣離子熒光探針) 是配制于無水DMSO (anhydrous DMSO)中的儲存母液，濃度為2mM。

（1）Annexin V/PI試劑盒為什么用不含EDTA胰酶？

Annexin V 是 Ca 依賴性蛋白， 所以不能加入 EDTA， 防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V， 進而影響結(jié)果。

（2）Annexin V/PI試劑盒做單染用普通細胞還是凋亡細胞？單染一定要做么？

單染一定要做，需要畫十字門調(diào)補償單染可以用正常細胞做，但是正常細胞凋亡有的比較少，畫門可能不是很清晰；建議設置經(jīng)凋亡誘導的正常細胞、PI 單染和 Annexin V-FITC 單染 3 個對照組，正常細胞組可作為熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。結(jié)果可用 CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC 為橫坐標，PI 為縱坐標。

（3）凋亡試劑盒Annexin V款受不受GFP等干擾？

美侖凋亡試劑盒有三款，Annexin V-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒；AnnexinV-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(50T)；其中貨號MA0220，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，F(xiàn)ITC發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光；貨號 MA0428 AnnexinV-FITC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒中，將PI更換為了 7-AAD，也發(fā)紅色熒光，但其發(fā)射光譜較PI窄，且發(fā)射波長更長，對其他檢測通道的干擾更??；貨號MA0429 AnnexinV-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒，選擇PE（MB5943藻紅蛋白）與Annexin V 偶聯(lián)，其中PE 的激發(fā)波長為為495,545或565nm ,發(fā)射波長575nm,發(fā)出紅色熒光，在多色熒光分析中，在待檢測的細胞已經(jīng)表達GFP等綠色熒光蛋白的情況下，推薦客戶選購Annexin V PE/7-AAD試劑盒。

（4）Annexin V-FITC/PI可以做貼壁細胞原位熒光檢測嗎?

美侖Annexin V-FITC/PI可以做原位熒光檢測，注意：一定要用試劑盒里的buffer；染料加量適當提高。

（5）單純檢測磷脂酰絲氨酸暴露的情況，不需要染核，可以用Annexin V/PI（MA0220）試劑盒么？

可以用的，不染核的話,不用PI就行了

(6) 細胞活力(活死細胞染色)檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒有什么區(qū)別？

細胞活力(活死細胞染色)檢測試劑盒（MA0361）是區(qū)別活細胞總數(shù)和死細胞總數(shù)；死細胞包括：壞死，死亡，凋亡； 細胞凋亡檢測試劑盒（MA0220）可以區(qū)別出活細胞，早期凋亡細胞，晚期凋亡細胞，壞死細胞

（7）TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒適用于組織切片嗎？

可以用于組織切片，如果是新鮮組織，需要固定液固定，做成切片

（8）Tunel實驗，加抗熒光衰減封片劑之后怎么保存呢？能保存多久？

常溫；避光放就行；保存時間具體得看熒光，但是熒光總會衰減；一般兩三天沒問題。

（9）Tunel怎么計算凋亡指數(shù)?

在共聚焦下,凋亡率(凋亡指數(shù))的計算方法如下:每個樣品隨機計數(shù)4個視野，按公式計算 凋亡指數(shù)(AI)：AI＝凋亡細胞數(shù)／(凋亡細胞數(shù)十正常細胞數(shù))。統(tǒng)計學方法 結(jié)果采用x土s表示，多組樣本均數(shù)用單因素方差分析，組間兩兩比較用Scheffe檢驗，兩樣本均數(shù)的比較用t檢驗.

（10）臺盼藍/活死細胞染色試劑盒區(qū)別

活死細胞染色試劑盒：Calcein AM是一種可對活細胞進行熒光標記的優(yōu)良染色試劑，其能夠輕易穿透活細胞膜。胞內(nèi)的酯酶會將其水解為Calcein(鈣黃綠素)留在胞內(nèi)，發(fā)出強綠色熒光；而碘化丙啶（PI）不能穿過活細胞的細胞膜，但其能穿過死細胞膜的無序區(qū)域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（激發(fā)：535 nm，發(fā)射：617nm），從而對死細胞染色。是基于鈣黃素AM和碘化丙啶（PI）的活死細胞染色試劑盒，可用于動物細胞樣品的活力和毒性檢測。而臺盼藍是細胞活性染料，常用于檢測細胞膜的完整性，還常用于檢測細胞是否存活。活細胞不會被染成藍色，而死細胞會被染成藍色。

（11）細胞周期試劑盒（MA0334）細胞染色時間到了，但是來不及上流式怎么辦？

可以先固定，加入 1ml PBS 充分重懸，成單細胞，輕輕邊渦旋邊緩慢滴加 3ml 預冷的無水乙醇，至 終濃度 75%，4℃固定 4h 以上，或者 4℃靜置過夜（18-24h）效果更佳。固定后的細胞 可以-20℃保存一個月，之后檢測時離心即可。

（1）CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)0.5-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。

（2）哪些物質(zhì)會影響CCK-8的測定？

當有氧化還原性物質(zhì)存在時會影響CCK-8的測定，因此當所加藥物為氧化還原性物質(zhì)時需要換液再進行檢測。

（3）CCK-8試劑盒如何設定空白對照？

在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

（4）CCK-8試劑盒鋪板細胞量有什么要求嗎？

96孔板細胞計數(shù)的時候一般是104，我們鋪96孔板，細胞濃度是5*104，取100ul鋪板;可以您自己對細胞計數(shù)，保證每孔細胞數(shù)量一致。或者可以計數(shù)，方法：按不同細胞數(shù)鋪板，貼壁后加cck，孵育1小時，然后檢測，OD值在1.5左右是最佳鋪板數(shù)

（5）CCK-8試劑盒反映時間怎么確定？數(shù)值必須是1么？

0.1-2.5都可以，最佳是1.0左右

（6）CCK-8試劑盒細胞能一邊培養(yǎng)一邊檢測？

培養(yǎng)一段時間測CCK-8，然后換液后可以接著養(yǎng)。

（7）做CCK-8經(jīng)常有氣泡，對吸光度有影響，有什么辦法去除么？

有氣泡，沒辦法去除，但是可以避免有氣泡，加藥時槍頭抵著孔壁，慢點加液體，基本不會產(chǎn)生氣泡，如有條件可將96孔板離心，這樣氣泡就會消失

（8）CCK-8試劑盒OD值偏高？

可以確認下培養(yǎng)時間，一般肉眼可見顏色變化即可檢測

（9）CCK-8除了用酶標儀還可以用什么儀器？紫外分光光度計行么？

一般CCK-8都是用酶標儀，紫外分光光度計最好不用，因為紫外我沒記錯一次只能測一個孔吧，而且還得把孔內(nèi)液體吸出來到紫外用的皿里，而且檢測時間很長，CCK-8對孵育時間敏感，這樣誤差太大了

（10）CCK-8會導致細胞死亡嗎？

CCK-8本身對細胞毒性特別小，作用時間長不會導致細胞都死亡，但是細胞長滿了，本身代謝會引起細胞死亡

（11）CCK-8試劑盒每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會有以下幾個原因：

1)當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

2)有可能會因為CCK-8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3)每孔的細胞數(shù)量過多或過少。請預先在1,000~100,000個/孔范圍內(nèi)摸索條件。

4) 重復試驗請保證孵育時間、接種細胞數(shù)相同。

(12)CCK-8試劑盒和EDU試劑盒區(qū)別：

如檢測單個藥的毒性推薦EDU，EDU檢測增殖最準確的方法,因為他是檢測DNA合成情況的，cck因為伴隨代謝，有些藥物影響到代謝，所以有時候最后測得的抑制率并不一定是和細胞毒性成正比的；但是DNA變化是準確的，而且可以用于流式     

如前藥物篩選化合物多的話建議用CCK-8,因為edu操作步驟比較復雜，不適合前期藥物篩選，cck反映速度快，操作簡單，適合前期實驗

（13）EDU細胞孵育時間怎么確定？

時間可以去ATCC上看下細胞倍增時間，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。

（14）3%BSA作用是什么?

3%BSA作用封閉穩(wěn)定熒光

（15）EDU試劑盒做流式怎么收集細胞呢？固定的細胞都是碎片了?

孵育完edu之后收集細胞，然后在固定，之后按照懸浮細胞往后做，每步均需要離心3200rpm/5min

（16） EdU染色之后，先用熒光顯微鏡測一下，再進行細胞核復染，再測一次呢，還是胞核染好了一起測就行？

都可以，可以染完edu，先用顯微鏡看下，然后在核復染，再看下；也可以染完edu，直接染核，然后在不同波長刺激下看。

（17）染完了要立即用熒光顯微鏡觀察嗎，可以放多久？

最好立即看，因為熒光有猝滅，如果想保存一段時間可以加封片劑，但是也建議先看一下在加封片劑，在觀察，因為加封片劑熒光也是有所衰減的，肯定沒有剛?cè)就甑暮?

（18）洗滌液通透液怎么配？

洗滌液是3gBSA加100ml的PBS；通透液TritonX是液體，也就是0.4ml到100mlPBS，配完放4度就行。

(1) 內(nèi)參過爆

大連美侖ECL是飛克級的，靈敏度比較高，內(nèi)參蛋白的話，建議使用的時候減少ECL用量，如果能調(diào)節(jié)時間的話，盡量時間短一些，如果手動曝光的話就1-2s就可以，一抗洗膜時間和洗膜次數(shù)可以適當延長

（2）曝光磷酸化蛋白比較模糊

可能原因：

1）因為磷酸化蛋白本身含量就少，特異性在不好，很容易出現(xiàn)這樣的條帶，抗體一定要買好一點的

2）目的蛋白如果較大，轉(zhuǎn)膜時間要延長，適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜時間

3）適當調(diào)高一抗二抗稀釋倍數(shù)

4）磷酸化封閉用tris體系的BSA，封閉時間可以長一點。

（3）預制膠兩邊marker有些傾斜或者不在同一條線上

預制膠存在邊緣效應，樣本允許的條件下可以把兩邊空出來，或者上一些廢樣做保護

（4）樣本-20℃放了一年了，還能用么？效果會不會有影響？

組織久了，效果會有點影響，但是不好說影響大不大，WB也是需要看具體蛋白情況，有些蛋白可能就是不好跑，您可以先做下預實驗，挑選幾個樣本，跑個內(nèi)參，看下蛋白彌散不？如果彌散了其他目的蛋白肯定也不好了，如果不彌散，還可以的話可以做下目的蛋白，但這個檢測只能說明樣本還能跑蛋白，但是不保證每個目的蛋白都一定能跑好

（5）loading buffer 加沒加蛋白酶抑制劑？

美侖的loading buffer 沒加蛋白酶抑制劑，蛋白酶抑制劑是在蛋白提取的時候加的，這只是一個上樣的緩沖液；緩沖液在沒有稀釋前，有高濃度的變性劑，蛋白酶是無法存在的

（6）蛋白印記膜再生液能否重復用？

試劑pH很重要，重復用會使pH升高，效果減弱，建議不要重復使用

（7）預制膠需要壓樣么？可以直接跑嗎？

美侖預制膠不用壓樣，直接跑就可以，電泳條件：150 V，30-40 min，當溴酚藍指示帶電泳至凝膠底部，或?qū)嶒烆A定位置時，即可結(jié)束電泳。如果想得到更加清晰平直的條帶，可降低電壓至 100-120V，并適當延長電泳時間。當然壓樣也可以，條帶可能會更加好看。

（8）sds-page用預制膠跑完不在一條線上？

可能原因：樣品的蛋白濃度或者離子影響了遷移速度，上樣量一樣，但是蛋白濃度不一樣，那么蛋白量就不一樣，蛋白的量相對越多，跑的越慢，但是做蛋白表達不影響結(jié)果的；或者也可以：如果蛋白濃度差的多建議調(diào)整濃度，可以讓蛋白量一致（比如都是20ug，根據(jù)蛋白濃度），調(diào)上樣量，差的多的可以用上樣緩沖液補.

（9）sds-page用預制膠跑完條帶有點彎曲？

電泳的時候保證內(nèi)槽液體不漏液，降低電泳電壓，濃縮膠60V，分離膠80V,，如果方便可以放些冰塊降溫，上樣前，樣品重新煮一下，冷卻離心，取上清

（10）sds-page用預制膠跑條帶出現(xiàn)笑臉。

可能原因：電壓高，遷移快，兩邊比中間慢，其實正常，想要改善可以調(diào)電壓到80V。

（11）sds-page用預制膠跑條帶出現(xiàn)哭臉

可能原因：蛋白堵塞，樣本可能是有雜質(zhì)堵住了膠孔，改善制樣過程。

（12）預制膠電泳槽內(nèi)槽加滿電泳液后，如看到個別膠孔里有絮狀物

用注射器或其他工具吸取電泳液輕輕吹打加樣孔，以去除加樣孔內(nèi)殘留的儲存緩沖液和雜質(zhì)，后在正常上樣。

（13）預制膠跑膠過程出現(xiàn)黃化

麻煩核對一下電泳緩沖液，美侖預制膠HEPS體系，不可使用tris-甘氨酸體系緩沖液，1X 變性凝膠電泳液參考配方為：100 mMTris, 100 mM HEPES, 0.1% SDS, 2 mM EDTA。

（14）預制膠適用于哪些儀器？

美侖預制膠兼容性強，兼容目前市場各種mini電泳槽, 包括：Bio-Rad Mini-PROTEAN (II/3 /Tetra System)；Hoefer Mighty Small (SE250/SE260/SE280)；Life Technology Novex Mini-Cell (請與免費提供的特制擋板配合使用)；北京六一 DYCZ-25E、DYCZ-24DN、DYCZ-24K、DYCZ-24KS、DYCZ-24KF；君意東方 JY-SCZ2+；天能 VE180；以及其它膠板寬度在10cm的電泳槽。如是伯樂款儀器可以參考說明書中膠條反裝，或者購買伯樂款專用

（15）裂解蛋白，呈果凍狀，還有點膠狀呢？

離心時間過長，基因組出來了，正常離心后，取上清就可以，DNA會在沉淀里面，12000rpm，或者重提的話裂解時間縮短一些。

（16）麗春紅染膜效果不好？

可能原因

1）膜上蛋白太少了，麗春紅識別率是要低于曝光的，可以正常曝光看下結(jié)果。

2）如果染膜之前用牛奶封閉過，封閉的蛋白染膜是不會在膜上的

部分產(chǎn)品由于本身熔點，自身性質(zhì)，就是液體狀態(tài)，例如肉桂醛，常溫就是液體。

因為粉末在液體中有一定的溶解度，尤其有的粉末用有機試劑溶解后需要用PBS，水稀釋，而產(chǎn)品本身不溶于水，這時候稀釋就會有析出，可以母液配置完成后超聲一下，稀釋之后再超聲水浴一下，這樣基本可以溶解；如析出的結(jié)晶依然存在，那就是溶解度達不到，需要調(diào)整下溶解度。

（1）超聲水浴加速溶解（2）如果是灌胃方式給動物可以混懸液（3）可以選一些助溶劑例如PEG300，吐溫80等。

同一產(chǎn)品不同批次之間存在差異，這是正?，F(xiàn)象，麻煩以收到本次產(chǎn)品的COA為主。

如果您購買的產(chǎn)品的量非常小，同時有些產(chǎn)品在凍干的過程中粘附在管壁上形成薄薄的一層，可能觀察不到產(chǎn)品的存在。您可以加入指定溶劑（參照操作手冊）并渦旋或超聲震蕩使之完全溶解。

對于蠟狀或油狀的產(chǎn)品很難取出稱量它們的質(zhì)量，我們建議您用合適的溶劑直接溶解該化合物；對于具有吸濕性的化合物，暴露在空氣中會吸收水分，呈現(xiàn)液滴狀，這種產(chǎn)品需要放置在干燥器中保存。