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原創(chuàng) 李輝 科學(xué)大院 11月16日 開(kāi)篇詞：

放線菌能產(chǎn)生抗生素，釀酒酵母能釀出美酒、藻類還能生產(chǎn)被譽(yù)為腦黃金的DHA……小小的微生物，能夠生產(chǎn)出各種各樣化合物，變成人類社會(huì)中的健康守護(hù)者（藥品）、能量之源（燃料）、情緒催化劑（酒精）……而如果有了生物工程師的介入，微生物可以變得更強(qiáng)，“變身”成“細(xì)胞工廠”，為人類謀求更大的福利。 先進(jìn)的微生物細(xì)胞工廠，可以讓人類獲得更加廉價(jià)的化學(xué)品。而工程師的技術(shù)越先進(jìn)，某種程度上代表國(guó)家在生物技術(shù)領(lǐng)域的競(jìng)爭(zhēng)力越強(qiáng)。 那么，工程師是如何打造微生物細(xì)胞工廠呢？各個(gè)環(huán)節(jié)會(huì)使用到哪些新技術(shù)？現(xiàn)在真的已經(jīng)有這樣的細(xì)胞工廠了嗎？大院er和生物工程師們推出了微生物“智”造專題，我們將為你講述這些“工廠”里的故事。

中國(guó)科學(xué)院有一位“億元教授”，在國(guó)外完成學(xué)業(yè)后回國(guó)組建實(shí)驗(yàn)室。他開(kāi)發(fā)出一種比較先進(jìn)的能夠產(chǎn)L-丙氨酸的“工廠”。技術(shù)轉(zhuǎn)讓后，企業(yè)迅速憑借他打造的“工廠”打敗諸多跨國(guó)大企業(yè)，將自己的市場(chǎng)占有率從18%提高到80%，也帶動(dòng)形成一個(gè)全新的產(chǎn)業(yè)鏈。而隨著企業(yè)的上市，這位老師也順利跨入了“億元教授”俱樂(lè)部。同時(shí)，從生產(chǎn)者到消費(fèi)者，很多人也因?yàn)檫@個(gè)工廠而受益（對(duì)此感興趣的小伙伴可以搜索第一條參考文獻(xiàn)~）。

上面說(shuō)到的“工廠”是啥？

區(qū)別于我們一般認(rèn)知中的工廠，這類“工廠”它其貌不揚(yáng)，沒(méi)有大煙囪，也沒(méi)有機(jī)械化的流水線，“占地”僅僅在零點(diǎn)幾到幾百微米之間，但是它們的產(chǎn)品卻是千家萬(wàn)戶生活中的必備之物，誰(shuí)擁有了建造這些工廠的先進(jìn)技術(shù)，誰(shuí)就擁有了更強(qiáng)的造福社會(huì)的能力以及源源不斷的財(cái)源。

這里所說(shuō)的“工廠”其實(shí)是微生物。微生物之所以能夠被當(dāng)作“細(xì)胞工廠”，一是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生各種各樣對(duì)人類有益的化學(xué)品，而這些化學(xué)品目前已被廣泛應(yīng)用到了包括食品、藥品、農(nóng)業(yè)及能源等眾多領(lǐng)域，二是因?yàn)榇嬖谝恍┛梢员环Q作生物工程師的人，這些人的工作就是去創(chuàng)造或強(qiáng)化微生物生產(chǎn)化學(xué)品的能力，正是他們的存在，才使得微生物對(duì)人類有益的特性能夠被無(wú)限放大，從而對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響。

既然微生物細(xì)胞工廠這么多金，那要靠它走上致富的道路需要經(jīng)歷什么呢？以下的這六個(gè)階段是必經(jīng)之路。

第一階段：利潤(rùn)和能力的匹配

建造微生物細(xì)胞工廠，面對(duì)的第一個(gè)問(wèn)題是用它產(chǎn)什么化合物？

單純從賺錢(qián)策略的角度來(lái)看，細(xì)胞工廠所產(chǎn)的化合物可以分為兩類。

一類是薄利多銷型化合物，又稱作大宗化學(xué)品，這類化學(xué)品的特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉并且社會(huì)和市場(chǎng)對(duì)它們存在巨大的需求，比如能被用作燃料的乙醇和丁醇就是其中典型的例子。

另一類是“一單回本”型化合物，又稱作精細(xì)化學(xué)品，這類化學(xué)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴，且一般沒(méi)有成熟的化學(xué)合成路線或合成成本太高。這類產(chǎn)品通常被應(yīng)用于醫(yī)藥或者化妝品領(lǐng)域，來(lái)源于馬達(dá)加斯加長(zhǎng)春花中的長(zhǎng)春新堿就是一個(gè)典型的例子，長(zhǎng)春新堿是一種潛在的抗癌化療藥物，從長(zhǎng)春花中提取一盎司（28.3g）的量就需要一噸的長(zhǎng)春花，花費(fèi)將近100萬(wàn)人民幣。

長(zhǎng)春花及長(zhǎng)春新堿（圖片來(lái)源：Veer圖庫(kù)、維基百科）

第二階段：讓合適的微生物去產(chǎn)

正確的化合物

選好產(chǎn)品之后，接下來(lái)的第二個(gè)問(wèn)題是把目標(biāo)化合物放到哪種底盤(pán)微生物中去生產(chǎn)？其實(shí)挑底盤(pán)微生物這件事，優(yōu)秀的工程師和優(yōu)秀的教師的理念有相似之處，好的老師會(huì)對(duì)不同的學(xué)生因材施教，而好的工程師也懂得選擇合適的微生物去生產(chǎn)它所擅長(zhǎng)生產(chǎn)的化合物，他們能夠憑借兩方面的經(jīng)驗(yàn)選出合適的底盤(pán)微生物。

一方面是對(duì)不同微生物先天優(yōu)勢(shì)的了解，比如梭菌（Clostridium sp.）比較適合生產(chǎn)可以用作化工原料的丙酮和丁醇；棒桿菌屬（Corynebacterium sp.）的微生物比較適合生產(chǎn)氨基酸；不透明紅球菌（Rhodococcus opacus）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）適合生產(chǎn)脂類、脂肪酸和其衍生物；而放線菌（Actinomycetes）則適合生產(chǎn)抗生素和聚酮類化合物。

左右滑動(dòng)查看多圖，從左到右依次為梭菌、棒桿菌、解脂耶氏酵母、放線菌（圖片來(lái)源：Science Photo Library及Marizeth Groenewald et al., 2014）

另一面是對(duì)不同微生物安全性的了解。有些由微生物產(chǎn)生的化學(xué)品是會(huì)直接被人類食用或者使用的，比如日常生活中的調(diào)味品和會(huì)直接涂抹到肌膚表面的化妝品。如果要生產(chǎn)這類化合物，工程師一般則會(huì)選擇所謂的公認(rèn)安全（GRAS：generally recognized as safe）的微生物作為底盤(pán)：釀酒酵母（S. cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、谷棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、 乳酸菌（Lactic acid bacteria）和惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida KT2440）都是比較有名氣的GRAS微生物。

三種明星GRAS微生物（左右滑動(dòng)查看多圖，從左到右依次為釀酒酵母、芽孢桿菌、乳酸菌丨圖片來(lái)源：維基百科、American Biosystems、2018 Dr.Horst Neve）

第三階段：設(shè)計(jì)化學(xué)品的“生產(chǎn)線”

底盤(pán)選好就可以設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)化合物的生產(chǎn)線了，所謂生產(chǎn)線，就是生產(chǎn)原料經(jīng)微生物代謝后轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化合物的途徑，這些代謝途徑的設(shè)計(jì)，根據(jù)難易程度的不同可以分成三個(gè)級(jí)別：

入門(mén)級(jí)設(shè)計(jì)的理念是沒(méi)有設(shè)計(jì)，在這種情況下所選的底盤(pán)中恰好就有能產(chǎn)目標(biāo)化合物的代謝途徑，比如釀酒酵母本來(lái)就能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇，用它產(chǎn)乙醇，在開(kāi)始階段就不用費(fèi)太多精力。

中級(jí)設(shè)計(jì)的理念是“移花接木”，其實(shí)也就是從其它物種中“抄答案”，借鑒得越多，對(duì)工程師的技術(shù)要求越高。

前兩年，首爾大學(xué)的工程師們想用釀酒酵母去生產(chǎn)一種能吸收紫外線的化合物-類菌孢素氨基酸（MAA），釀酒酵母自己本身不能生產(chǎn)MAA，但藍(lán)細(xì)菌可以。于是她們利用基因編輯技術(shù)，把藍(lán)細(xì)菌中的四個(gè)基因人為的在釀酒酵母中表達(dá)，就和釀酒酵母中已有的代謝途徑一起搭建起了完整的MAA合成途徑。

而困難版的“移花接木”，往往需要更廣泛的借鑒，比如斯坦福的工程師們?cè)?jīng)在釀酒酵母中設(shè)計(jì)并搭建出了本來(lái)只存在罌粟中的阿片類藥物生產(chǎn)線，在搭建的過(guò)程中，她們總共向釀酒酵母中表達(dá)了多達(dá)20多個(gè)來(lái)源于植物、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌以及酵母菌本身的基因。

用7個(gè)物種來(lái)源的基因在釀酒酵母體內(nèi)設(shè)計(jì)并搭建的阿片類藥物合成途徑（圖片來(lái)源：中科院植物所北京植物園、 Science Photo Library、維基百科、Stephanie Galanie et al.,2015）

高級(jí)的設(shè)計(jì)理念是“無(wú)中生有”，專業(yè)化的表述叫做“反向合成”，這個(gè)策略適合那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物合成途徑不清楚的化合物。

其大致過(guò)程是將復(fù)雜化合物可能的前體通過(guò)枚舉的方式列出來(lái)，再將其前體的前體列出來(lái)，重復(fù)這個(gè)步驟，直到列出的化合物是一個(gè)足夠簡(jiǎn)單的化合物。此時(shí)會(huì)得到很多條從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的合成途徑，接下來(lái)就是尋找最優(yōu)途徑，找到后設(shè)計(jì)就算是完成了。

反向合成原理（圖片來(lái)源：Centre for Molecular and Biomolecular informatics）

第四階段：讓微生物細(xì)胞工廠更“皮實(shí)”

微生物細(xì)胞工廠作為有生命的個(gè)體，由于需要承受來(lái)自工程師的厚望，一般工程師會(huì)希望它們能夠“皮實(shí)”一些，對(duì)環(huán)境中的抑制因子不要過(guò)于敏感，比如希望它們?cè)诟咝a(chǎn)目標(biāo)化學(xué)品的同時(shí)，還能夠抵抗生產(chǎn)過(guò)程中濃度產(chǎn)物對(duì)微生物的毒性等影響。

為了讓微生物變得更皮實(shí)，工程師一般會(huì)采用兩種手段：

如果對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生毒性的分子機(jī)制很了解，工程師一般會(huì)對(duì)底盤(pán)微生物進(jìn)行針對(duì)性的改造。比如：如果微生物分泌到細(xì)胞外的化合物再次回到細(xì)胞內(nèi)會(huì)對(duì)微生物有毒性時(shí)，工程師可以通過(guò)改造微生物，來(lái)堵死這種有毒化合物進(jìn)入細(xì)胞的途徑；再比如目標(biāo)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)濃度過(guò)高也會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)時(shí)，增強(qiáng)微生物的對(duì)該化合物的轉(zhuǎn)出能力就是一種很好的解決策略；

如果對(duì)化合物毒性產(chǎn)生的機(jī)制不甚了解，工程師往往會(huì)采取簡(jiǎn)單粗暴的篩選加改造。

這種方法叫做實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化，就是把微生物放到含有毒性化合物的培養(yǎng)基中不斷的傳代，傳代過(guò)程中同時(shí)也逐漸增加毒性產(chǎn)物的濃度，最后在毒性化合物濃度最高的培養(yǎng)基中存活下來(lái)的微生物會(huì)被選擇出來(lái)，然后從基因組水平上去檢查它與之前有什么不同，找到能夠賦予抵抗毒性的關(guān)鍵突變，然后再對(duì)正常的微生物定向改造，即可獲得具有抗性的微生物。 

不同條件下對(duì)微生物進(jìn)行連續(xù)的馴化（圖片來(lái)源：Choi, K.R., et al., 2019）

第五階段：優(yōu)化“生產(chǎn)線”

評(píng)價(jià)一個(gè)微生物細(xì)胞工廠產(chǎn)化合物的過(guò)程是否有競(jìng)爭(zhēng)力主要看三個(gè)參數(shù)，分別是：滴度（Titer），即目標(biāo)產(chǎn)物的濃度；收率（Yield），即所得到每克目標(biāo)化合物和所投入每克原料的比值；生產(chǎn)率（Productivity），即單位時(shí)間、體積或者單位細(xì)胞所生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物量的比率。一般而言，這三個(gè)參數(shù)是越高越好，所以如果想要足夠高的效率和利潤(rùn)，光有目標(biāo)產(chǎn)物的代謝途徑是不夠的，還需要對(duì)“生產(chǎn)線”也就是代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化，確保生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的生產(chǎn)線能在微生物中更高效的運(yùn)行。 

細(xì)胞內(nèi)主要的代謝途徑（圖片來(lái)源：2003 International Union of Biochemistry and Molecular Biology）

對(duì)微生物有一些了解的人會(huì)知道，它們細(xì)胞內(nèi)部的代謝途徑其實(shí)是由很多條代謝途徑組成的復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)，只有對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性具有足夠的認(rèn)識(shí)，改造起來(lái)才事半功倍。

目前，工程師可以方便的從基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等多種組學(xué)水平去理解細(xì)胞內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)有了全貌性的了解之后，工程師就有底氣對(duì)內(nèi)源的代謝途徑做修改了，修改這些內(nèi)源的代謝途徑的指導(dǎo)原則主要是“開(kāi)源節(jié)流”，即為增加目標(biāo)化合物前體的供應(yīng)并避免目標(biāo)化合物轉(zhuǎn)化成其它化合物。

第六階段：微生物細(xì)胞工廠的放大

對(duì)于工程師而言，前五個(gè)階段如果都能順利完成，也不一定能拿到錢(qián)，還需要一個(gè)從實(shí)驗(yàn)室走向生產(chǎn)的關(guān)鍵過(guò)程——微生物細(xì)胞工廠的放大。

微生物細(xì)胞工廠的放大過(guò)程（來(lái)源：Yoo-Sung Ko et al., 2020）

工程師構(gòu)建好微生物細(xì)胞工廠后往往只會(huì)在實(shí)驗(yàn)室對(duì)它進(jìn)行性能測(cè)試，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞工廠的規(guī)模往往在數(shù)百毫升到30升之間，測(cè)試性能達(dá)標(biāo)后，還會(huì)在中試規(guī)模繼續(xù)進(jìn)行驗(yàn)證，中試規(guī)模培養(yǎng)微生物的反應(yīng)器容積往往在30到3000升之間，但這樣的規(guī)模相對(duì)于實(shí)際需求還是太小。

更大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)一般會(huì)由企業(yè)來(lái)做，先經(jīng)歷一個(gè)規(guī)模在3000到20000升的工藝驗(yàn)證階段，仍然沒(méi)有問(wèn)題后，就可以在20000到2000000升的運(yùn)行規(guī)模中正式上崗，發(fā)光發(fā)熱了。

如何能夠成為生物工程師？

這六個(gè)階段都結(jié)束后，短期來(lái)看，開(kāi)發(fā)工廠的工程師和企業(yè)可能會(huì)在大賺一筆，能夠填補(bǔ)由于前期研發(fā)“砸錢(qián)”消耗的元?dú)?；長(zhǎng)期來(lái)看，如果工程師和企業(yè)聯(lián)手能創(chuàng)造出更好、更有意義的的微生物細(xì)胞工廠，那么同樣的成本，產(chǎn)物供應(yīng)量相應(yīng)上升，最終消費(fèi)者購(gòu)買的價(jià)格則會(huì)有所降低。所以打造微生物細(xì)胞工廠，無(wú)論對(duì)生產(chǎn)者（工程師、企業(yè)）還是消費(fèi)者（社會(huì)）都是具有重大意義的。不過(guò)就成本來(lái)看，目前要建這樣的“工廠”還是有很大的挑戰(zhàn)，新的技術(shù)是降低成本和縮短周期的關(guān)鍵，接下來(lái)的文章里會(huì)對(duì)一些先進(jìn)生物技術(shù)進(jìn)行深度解讀。

有些小伙伴看到生物工程師靠微生物細(xì)胞工廠走上致富之路，就也想效仿？

等等，你可千萬(wàn)別急著入行，不妨再來(lái)看看你個(gè)人需要經(jīng)歷些什么才能靠這種模式賺錢(qián)吧！

首先需要經(jīng)歷系統(tǒng)、專業(yè)的訓(xùn)練，至少獲得一個(gè)與生物學(xué)相關(guān)的博士學(xué)位，成為一個(gè)優(yōu)秀的博士，對(duì)以上六個(gè)階段了然于胸的同時(shí)還得是某個(gè)細(xì)分領(lǐng)域的專家。在經(jīng)過(guò)調(diào)研確定下來(lái)一個(gè)有市場(chǎng)前景自己也能做的來(lái)的化合物之后，你還得能組織起一個(gè)擁有在這六個(gè)階段都有所長(zhǎng)的研究人員的團(tuán)隊(duì)，之后你的團(tuán)隊(duì)可能還需要幾年的時(shí)間去攻關(guān)從微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建到大規(guī)模應(yīng)用所面臨的所有問(wèn)題，整個(gè)過(guò)程中你還需要充足的資金作為物質(zhì)基礎(chǔ)，這筆錢(qián)的數(shù)額大概會(huì)超過(guò)千萬(wàn)美元。以上人力、物力及時(shí)間的成本是目前構(gòu)建出一個(gè)在經(jīng)濟(jì)上有競(jìng)爭(zhēng)力，能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的微生物細(xì)胞工廠所需成本的平均水平。

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